[摘要] 目的 探讨赤芍水提物对肺癌细胞的抑制效应。 方法 选取人肺腺癌细胞A549、H1299以及小鼠Lewis肺腺癌细胞（LLC）为靶细胞，接种于6孔板或96孔板，接种密度为5×104/孔和3×103/孔，加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L不同浓度的赤芍水提物培养1～3 d，以0 g/L浓度的赤芍水提物处理组作为对照组，分别采用镜下观察、细胞计数仪以及细胞计数试剂盒（CCK-8）、流式细胞学检测细胞生长状态。 结果 镜下直接观察，与对照组（0 g/L浓度）比较，不同浓度的赤芍水提物处理后肺癌细胞数量明显较少，0.5 g/L浓度组细胞生长状态不佳，细胞增殖受到明显抑制，抑制率为43%（P < 0.05）。流式细胞学检测显示，经赤芍水提物处理后，A549细胞周期阻滞于G1期。动物实验表明，赤芍可以抑制LLC皮下移植瘤的生长。 结论 赤芍中药可以抑制肺癌细胞的生长。
[关键词] 赤芍；肺癌；增殖抑制；抗肿瘤
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（c）-0021-05
Inhibition effect study of aqueous extract from Paeonia veitchii on lung cancer cell
LUO Yingbin1，2 WU Jianchun1 FANG Zhihong1 ZHU Shiguo2 LI Yan1
1.Department of Oncology， Shanghai Chinese Medicine Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200071， China； 2.School of Basic Medical Sciences， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China
[Abstract] Objective To study the inhibition effect of aqueous extract from Paeonia veitchii on lung cancer cell growth. Methods A549， H1299， LLC cells were separately seeded in 6-well plates or 96-well plates. Different concentration （0， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0.7， 0.8， 0.9， 1.0 g/L） aqueous extract from Paeonia veitchii were added into culture system， with 0 g/L concentration group as control group. At different time point， the cell morphology， proliferation and apoptosis were detected by microscopy， CCK-8 kit， flow cytometry. Results Compared to control group （0 g/L）， the cell number of Paeonia veitchii treated group obviously decreased and the growth inhibitory effect was about 43% （P < 0.05）. The cell morphology was lost and cells cycle was inhibited in G1 phase. Animal experiments showed that the growth of LLC tumors could be inhibited by Paeonia veitchii. Conclusion Paeonia veitchii aqueous extract has a certain inhibitory effect on lung cancer cell growth.
[Key words] Paeonia veitchii； Lung cancer； Proliferation inhibition； Anti-tumor
活血化瘀中药在肿瘤临床治疗中被广泛地应用。然而活血化瘀药的应用尚存争议，因为其涉及到是否能促进肿瘤细胞血行转移的问题[1-2]。本实验选取临床中较为常用的一味活血化瘀中药赤芍，检测其对肺癌细胞的抑制增殖情况，肺癌皮下移植瘤小鼠模型经赤芍活血中药治疗后肿瘤生长状况，探讨活血中药赤芍与肿瘤生长转移的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，5周龄。购于中国科学院上海生命科学研究院斯莱克实验动物有限公司，并饲养于上海中医药大学实验动物中心。10只C57BL/6小鼠随机分对照组（5只，生理盐水灌胃，每天200 μL/只），赤芍组（5只，赤芍水提物200 g/L灌胃，每天200 μL/只），实验重复3次以上。
1.2 瘤细胞株
A549、H1299、肺腺癌（LLC）细胞株，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。
1.3 赤芍水提物
赤芍水提物由上海市中医医院中药房提供，等份用PBS液配制成相当于含生药1 g/mL中药液。根据提取物浓度，将其分为对照组（0 g/L），0.1 g/L浓度组、0.2 g/L浓度组、0.3 g/L浓度组、0.4 g/L浓度组、0.5 g/L浓度组、0.6 g/L浓度组、0.7 g/L浓度组、0.8 g/L浓度组、0.9 g/L浓度组、1.0 g/L浓度组。
1.4 CCK-8检测细胞增殖
A549、H1299细胞按3×103接种于96孔板，加入不同浓度梯度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L）的赤芍水提物，37℃，5%CO2，培养24、48、72 h，培养体系为100 μL，培养基为DMEM（A549）及1640（H1299），培养液含有10%新生小牛血清（Gibco，美国），每孔加入10 μL CCK检测试剂，4 h后酶标仪扫描，扫描波长为450 nm，每个浓度组样本数为6。
1.5 细胞划痕实验
A549、H1299细胞按5×104接种于6孔板，37℃，5%CO2，培养24 h，于每孔中间划一均匀大小的划痕，加入0.5 g/L浓度的赤芍水提物，继续培养24 h，光镜下观察细胞爬行能力。
1.6 流式细胞学细胞周期检测
A549、H1299按5×104接种于6孔板，加入0.5 g/L浓度的赤芍水提物，37℃，5%CO2，培养24 h，收集细胞，采用细胞周期试剂盒（碧云天）进行染色，上流式检测细胞周期。
1.7 动物处理
将10只C57BL/6黑鼠随机分为对照组（5只，生理盐水灌胃，每天200 μL/只），赤芍组（5只，赤芍水提物200 g/L灌胃，每天200 μL/只）。每只小鼠腋下皮下接种3×106 LLC细胞。第2天赤芍组予赤芍水提物200 g/L灌胃，每天1次，每次200 μL，灌胃40 d；对照组予0.9%生理盐水灌胃，每天1次，每次200 μL，灌胃40 d。第3天开始通过游标卡尺测量皮下移植瘤体积大小，根据公式[3]计算瘤体体积：V=（π/8）a×b2，其中，V=肿瘤体积，a=瘤块最长直径，b=瘤块最短直径。实验重复3次以上。
1.8 统计学方法
采用统计软件SPSS 12.0对实验所得数据进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，重复测量的计量资料比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1细胞增殖实验
96孔板中每孔铺3000个细胞，A549、H1299细胞在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L不同浓度的赤芍水提物处理24、48、72 h后，加入CCK-8试剂，分别检测其对不同NSCLC细胞系的抑制效应，并与对照组（0 g/L浓度）比较，计算其抑制率。结果显示随着赤芍水提物浓度的增加，A549、H1299细胞增殖受到抑制。0.5 g/L浓度组对A549细胞存在最大的抑制生长作用， 但不同浓度组间差异无统计学意义（P > 0.05），故赤芍水提物对A549的抑制不呈剂量依赖。H1299随着赤芍浓度的增加，细胞增殖逐渐下降，有明显的增殖抑制效应。而且高浓度组（1 g/L浓度）与低浓度组（0.1 g/L浓度）比较，组间差异有统计学意义（P < 0.05），故赤芍水提物对H1299的抑制呈一定的剂量依赖。见图1。
a：A549；b：H1299不同浓度药物组分别与对照组（0 g/L浓度）比较，*P < 0.05
图1 赤芍水提物对A549、H1299细胞增殖的影响
2.2 镜下直接观察
细胞贴壁后加入0.5g/L浓度药物，作用24后，电镜下观察细胞形态变化：对照组（0 g/L浓度）细胞生长状态良好，排列紧密，形态成梭形，细胞之间形成连接。赤芍水提物0.5 g/L浓度组细胞生长稀疏，大部分细胞成皱缩状态，数量更少，细胞连接大大减少。见图2。
2.3 流式细胞周期检测
赤芍对细胞增殖有明显的抑制效应，为明确对细胞的抑制周期，进行流式分析。0.5 g/L浓度药物处理细胞24 h后，收集5×105细胞按流式细胞检测试剂盒protocol处理后，上BD流式仪检测，结果显示，经0.5 g/L浓度组处理的A549和H1299细胞和对照组（0 g/L浓度）相比，细胞周期的分布比例发生变化，A549细胞G1期细胞比例由48%上升到86%，H1299细胞G1期细胞比例由39%上升到60%，可见赤芍诱导A549和H1299细胞阻滞于G1期。见图3。
2.4 细胞划痕实验
为研究活血化瘀中药对细胞迁移能力的影响，细胞贴壁后，划一粗细大小一致的划痕，对赤芍处理后的A549细胞进行划痕迁移实验，加入0.5 g/L药物作用24 h后，电镜下观察。结果显示，0.5 g/L浓度组与对照组（0 g/L浓度）相比，A549细胞爬行能力和迁移能力明显降低。说明赤芍处理显著降低非小细胞肺癌细胞的迁移能力。见图4。
2.5 动物实验
小鼠随机分成两组后，将3×106 LLC细胞接种于小鼠背部皮下，赤芍组予中药每日灌胃，对照组予生理盐水每日灌胃，每次200 μL，每3天测量1次瘤体大小，实验重复3次以上。体外实验表明，赤芍水提物能一定程度抑制非细胞肺癌细胞的生长、增殖、迁移，体内动物实验也表明赤芍能抑制LLC肺癌皮下移植瘤的生长。见图5。
A：C57BL/6黑鼠LLC皮下移植瘤的体内生长曲线；B：瘤体（左边为对照组，右边为赤芍组）；与生理盐水对照组小鼠肿瘤组间不同天数体积比较，*P = 0.00163 < 0.05
图5 赤芍水提物对C57BL/6荷瘤鼠体内抑瘤能力影响
3 讨论
活血化瘀中药在肿瘤临床治疗中的应用还存在不同的争议，究竟肿瘤患者是否可以使用活血化瘀中药尚不明确。郑平菊等[4]认为活血化瘀改善了肿瘤的血液供应，减少了细胞凋亡，就等于减少了增殖和转移的刺激和压力。也有学者认为，某些活血化瘀方药有促进肿瘤扩散和转移、降低免疫功能及加重出血的作用，认为在细胞免疫功能减退时，使用抗凝剂包括活血化瘀药溶解血栓及癌栓，可使癌栓中癌细胞释放入血，耗竭机体免疫力，加速血行播散[5]。赤芍为毛茛科植物芍药或川赤芍的干燥根，具有清热凉血、通经及清肝消痈的功效，主治瘀滞经闭、症瘕积聚、腹痛胁痛、衄血血痢、肠风下血、目赤痈肿，为临床中较为常用的一味活血化瘀中药。有学者[6]对其门诊552例肝癌患者用药分析发现，赤芍是其处方中最为常用的活血化瘀中药之一。其药效成分主要是以芍药苷为主的单萜及其苷类成分、没食子酸及其衍生物等[7]。现代药理研究表明，赤芍具有多种药理功能，主要作用于心血管系统，另外还具有抗肿瘤、抗内毒素、调节免疫等功效。Sheng等[8]研究发现，赤芍水提物可诱导肝癌细胞HepG2发生凋亡，并具有一定的时间和剂量依赖性，主要表现在G1期的细胞数量增多，凋亡相关基因Bcl-2的表达下调，Bax和p53基因表达上调，促细胞凋亡蛋白酶caspases-3和9被激活。Xu等[9]研究发现，赤芍抗肿瘤诱导细胞凋亡可能的机制是Bc-l-2与Bc-l-Xl含量降低，能够促进MPT开放和降低线粒体Δφm，进而促使Cyto-C和AIF从线粒体释放入细胞质，并增加了ROS的生成，降低胞内GSH含量并促进其向胞内转移，caspase-3被激活和降解PARP。Bax含量增加可以构成跨线粒体外膜的孔，并导致膜电位的降低和细胞色素C及凋亡诱导因子的外流，细胞色素C与Apaf-1和ATP及pro-caspase-9形成复合物并导致caspase-9的激活。与细胞色素C的结合使Apaf-1与pro-caspase-9的结合能力更强[10-11]。Xu等[12]研究发现，赤芍能明显抑制S180肿瘤细胞的生长增殖，并能通过增加血清IL-2和IL-4的水平增强NK细胞的细胞毒性。较多实验都表明赤芍具有一定的肿瘤抑制效应。不过丁罡等[13]发现，赤芍中药具有抑制肿瘤细胞的作用，但其能促进大鼠移植瘤高表达VEGF及肿瘤血管的形成，肿瘤细胞侵入结构、功能不完全的肿瘤血管，发生远处转移。但也有学者[14]认为活血化瘀使纤维蛋白原溶解，血小板解聚，降低血黏度，改善癌灶周围微循环，防止癌细胞粘着，具有防止肿瘤转移的作用。
本实验结果提示：赤芍中药能抑制非小细胞肺癌细胞的生长、增殖及迁移，能将细胞明显阻滞于G1期，并能有效抑制C57BL/6黑鼠肺癌皮下移植瘤的生长。本实验通过采用现代分子生物学方法，初步探讨了活血化瘀中药与肺癌肿瘤转移的关系，为临床选择性地应用活血化瘀中药抗肿瘤治疗提供科学依据。
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（收稿日期：2014-09-01 本文编辑：卫 轲）