林 源 ，谭 磊，何世成，唐小明，王卫国，王昌建
（1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南 长沙 410014；
2.湖南农业大学，湖南 长沙 410128）
猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）属于疱疹病毒科成员，该病原宿主范围广泛，可感染多种哺乳动物（包括家畜和野生动物），并导致伪狂犬病（pseudorabies, PR）。PR主要以发热、脑炎或奇痒等临床症状为特征，不同动物感染PR后所表现的临床症状差异较大[1]。其中毛皮动物（如牛、羊、兔和狐狸等）以瘙痒、神经症状等为主，且死亡率高达100%；
但猪感染不会出现瘙痒，可出现脑炎、腹泻和发热等，且死亡率相对较低。猪（包括家猪和野猪）是PRV的自然宿主，在自然环境下猪群感染PR的主要途径是通过口鼻直接或间接接触病原而感染。不同日龄猪群感染该病后表现的临床症状差异较大，2周龄内的新生仔猪表现出神经症状、腹泻等，且死亡率较高；
肥育猪感染后仅出现轻微的呼吸道症状及食欲不振等；
妊娠母猪则出现严重的繁殖障碍疾病[2]。
得益于PRV-gE基因缺失疫苗（如Bartha株），我国的PR流行情况得到有效的抑制，甚至部分地区猪场将PR进行了成功净化。2011年末，我国河南地区部分已免疫PRV疫苗的猪场仍然暴发了PR，其后该病以河南地区为中心，在我国各省市猪场广泛报道。研究人员对致病原进行分离鉴定后，发现其病原特征与PRV相同，且进一步进行基因序列特征性分析发现此类毒株的某些基因（gB、gE和gD等）与PRV传统株（如Ea和Fa株）、PRV疫苗株（如Bartha株）对应基因序列有很大的差异，如连续氨基酸序列缺失或插入、单个氨基酸突变等，部分变异区域处于病原的抗原区域，故研究人员又将新发的PRV毒株称为PRV变异株[3]。
随着PR在我国各地区猪场的广泛流行，导致PRV接触其它哺乳动物的几率提高，特别是一些偏远地区农户将猪和其它PRV易感动物（如牛、羊和狗）混养，这导致其它动物感染PR的几率提高。此外，也有越来越多食肉动物食用感染PRV的猪肉或猪内脏而感染PR的案例被报道，且这些报道在山东、河南等地区较为常见。此外，近年来PRV可感染人这一事实也逐渐引起国内外专家学者的广泛关注[3]。
自2011年以来，国内学者进行了大量的工作以监测PRV血清学流行情况，但不同地区数据质量差异较大。湖南农业大学Tan等曾对2011—2019年期间全国各地区猪PRV-gE抗体检测结果数据进行统计发现，全国共29个省市开展过PRV野毒血清学调查研究，其调查数据共包括256 326份血清样本，其中76 553份样品检测为PRV-gE抗体阳性，平均阳性率近30%（29.87%），其中9个省市被调查样品PRV-gE抗体阳性率超过30%[2]。杨汉春等曾于2016—2018年对我国规模化猪场伪狂犬病病毒血清学感染情况进行调查，结果发现2016—2018年被调查地区PRV-gE抗体场阳性率分别为80.93%、81.92%和75.75%，样品阳性率分别为36.03%、34.52%和32.45%。进一步分析发现不同地区样品阳性率存在很大差异，以2018年为例，黑龙江、天津、湖南和内蒙古等地区阳性率较低，但北京、安徽和辽宁等地区阳性率则较高。此外，PRV野毒感染与猪群生产模式、种公猪是否感染等具有一定关系[4]；
王昌建等调查结果表明，2018年湖南省规模化猪场PRV-gE场阳性率为38.9%，样品阳性率为21.0%，其中不同规模化猪场中以母猪存栏量高于1 000头的猪场PRV-gE阳性率最高（22.9%），且夏季猪群PRV-gE抗体阳性率最高（25.1%）[5]；
Zheng等调查结果发现，2018—2019年河南省被调查猪群血清PRV-gE抗体阳性率为30.14%（1 419/4 708），其中不同发育阶段猪群中以肥育猪阳性率最高[6]。
为确切知晓PRV在猪群的分子生物学流行情况，很多研究人员针对PRV的特定基因（如gE、gD和gC等）设计相应的病原诊断方法（如PRV、realtime PCR法等）对PRV核酸进行检测。诚然，由于PRV核酸检测过程相对复杂，且检测过程需要专业的仪器和工作人员，这导致PRV的分子流行病学研究相对血清学研究较少。湖南农业大学Tan等曾对2011—2019年国内发病猪群PRV分子流行病学调查结果进行统计，27个具有代表性的研究报告中采集了16 256份组织样品用于PRV核酸检测，其中有4 742份（约8.0%比例）样品为阳性[2]。华中农业大学Sun等[7]在2012—2017年对我国27个省市送检病料进行PRV核酸检测，调查结果发现16 256份组织样品中有1 345份样品为阳性，其平均阳性率为8.27%，且2012—2017年被检样品PRV核酸阳性率分别为11.92%、12.19%、6.70%、11.10%、5.57%和6.90%；
不同地区中以山东、江苏、福建等东部省份检出率相对较高（平均检出率为11.60%），而北部省份（如青海、新疆和甘肃等）检出率相对较低，平均阳性率为6.97%。汪一平等[8]对豫西地区采集的临床病料进行检测发现，2016—2020年该地区PRV病原检出率为13.82%（21/152），其中以2017年和2018年检出率相对较高，分别为20.69%和19.05%。周莉媛等于2019—2020年对四川省11个地区送检病料进行PRV核酸检测发现，466份病料中有51份为阳性，平均阳性率为10.94%，且不同发育阶段猪群阳性率存在较大差异，其中肥育猪、保育猪、妊娠母猪阳性率均超过11%，分别为17.96%、11.26%和13.41%；
哺乳仔猪、种公猪阳性率较低，分别为4.76%和2.63%[9]。从以上调查数据来看，我国猪群送检病料中PRV核酸平均检测阳性率为10%左右，虽然在地区上有很大的差异，但病原检出率始终低于基于PRV-gE的血清学检出率。这是由于猪群感染PRV后可终生带毒，这导致猪群体内PRV-gE抗体可长时间保持阳性；
且PRV在潜伏感染时可存在于三叉神经节和扁桃体，这时猪群既不会发病，也不会排毒，病原学监测过程中不容易检测到PRV核酸的存在。
PRV属于DNA病毒，其基因组较为稳定，虽然PRV广泛流行于世界各地，但其仅存在一种血清型，尽管不同毒株的毒力或致病力存在很大的差异。根据PRV基因组（如gC基因）特征，可将全世界流行的PRV毒株分为2个基因型，分别为genotype Ⅰ和genotype Ⅱ型，其中大部分国外（如欧洲、美国等地区）流行PRV毒株属于genotype Ⅰ型，而大部分国内和亚洲部分地区（如日本）流行PRV毒株属于genotype Ⅱ型。此外，当前国内流行的毒株中存在genotype Ⅰ、genotype Ⅱ型，且genotype Ⅲ毒株可再次分为genotype Ⅱ-A和genotype Ⅱ-B亚型，其中，国内2011年以前流行的PRV毒株主要属于genotypeⅡ-A，而2011年以后流行的毒株则主要属于genotypeⅡ-B型。此外，南京农业大学动物医学院Su等比较了国内流行PRV变异株、传统株和疫苗株之间的氨基酸序列遗传多样性，发现变异株（Qihe547毒株）与国内流行变异株、传统株和疫苗株氨基酸序列同源性分别为99.54%、98.84%和95.06%，其中在某些基因序列中变异株与疫苗株存在很多的氨基酸差异，其中包括有氨基酸插入或缺失。以gC基因为例，与国外genotype Ⅰ基因型流行株相比，国内变异株和传统株氨基酸序列中第63～69位均存在7个氨基酸连续插入（63AAASTPA69）。
此外，虽然DNA病毒基因组较为稳定，但大量不同基因型的PRV毒株流行也容易导致PRV重组毒株的出现（虽然重组可能性较低）。南京农业大学Zhia等对我国2017—2019年流行的PRV毒株部分序列进行分析时发现，2株来自于福建地区的毒株（FJ-W2和FJ-ZXF）gD和gE基因序列与国内流行的变异株（genotype-Ⅱb）同源性最高，但其gB基因却与国外流行的疫苗株（genotype Ⅰ）在进化树上位于同一分支，提示这两个毒株在不同基因型之间发生了重组。此类报道还有很多，其中中国农业科学院哈尔滨兽医研究所Liu等研究发现，基于MCC法构建的PRV基因组全长的系统进化树HLJ-2013毒株位于genotype Ⅰ和genotype Ⅱ之间，其分支虽然也是在genotype Ⅱ之中，但与genotype Ⅱ其它毒株（如传统株Ea和变异株HN1201）均不在一个分支上；
且进一步研究发现，该毒株基因组多区域出现重组，其UL27和UL36基因位于两种基因型毒株之间，UL17和UL37基因位于genotype Ⅰ基因型，但US4和US6基因则与genotype Ⅱ毒株中传统株相距最近。虽然当前已经有很多PRV重组毒株被鉴定出来，但与PRV变异株或疫苗株相比，这些重组毒株的毒力和致病性是否发生了变化还有待进一步的研究探索。
4.1 血清学诊断技术
血清学检测技术是基于抗原与抗体的特异性结合反应，同时结合相应的可视化检测方法。动物感染病原后可针对病原结构蛋白而产生特异性的抗体，且这些特异性抗体存在于血清中。因此，研究人员可通过静脉采集血液，其后分离血清，应用血清学诊断技术对特定病原抗体进行检测。
针对PRV的血清学诊断技术较为特殊，PRV基因组庞大，可编码多种蛋白，其中部分基因（如TK）仅与病毒毒力相关，而与病毒的免疫原性无关。目前绝大部分PRV疫苗是gE基因或多基因缺失疫苗，猪群免疫接种此类疫苗后可产生针对PRV的中和抗体，但不会产生gE蛋白抗体，而野毒感染后的猪群可产生gE蛋白抗体，因此靶向gE抗体设计的血清学检测方法可区分野毒感染和疫苗接种猪群。目前很多企业或科研单位开发了系列针对PRV的血清学诊断技术，根据原理主要可分为酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光技术（IFA）和血清中和试验（IHA）等。
4.1.1 ELISA检测技术 ELISA（酶联免疫吸附试验）检测技术是OIE（世界动物卫生组织）推荐首选的血清学诊断方法，其具有很高的简便性和敏感性，适合大量样品的快速检测，因此，ELISA是目前实验室诊断血清抗体最常用的一种检测方法。目前，美国爱德士（IDEXX）公司生产的PRV-gE和gB抗体ELISA检测试剂盒是同类产品中最为权威的，该公司于20世纪80年代就已开发了此类ELISA试剂盒，并于1988年成为美国官方首个批准的PRV鉴别诊断试剂盒，在美国PR净化项目中发挥了重要作用。但为降低检测成本，国内部分单位自主研发了PRV鉴别诊断试剂盒，部分产品的敏感性和特异性与IDEXX公司产品相比不相上下。
4.1.2 间接免疫荧光技术 IFA（间接免疫荧光技术）是一种实验室用于诊断特定病原的方法，其原理是抗原与抗体的特异性结合，但最终观察结果需要借助荧光显微镜。其基本步骤是将已知抗体与病原充分结合，其后用洗涤液将未结合抗体洗去，然后用荧光标记的抗抗体（抗IgG或IgM抗体）与抗体结合，如果已知抗体与病原发生特异性结合，则在显微镜下可观察到荧光，若未结合则观察不到荧光。因此，该方法可用于病原的检测，且该方法也可以检测病原在特定组织或细胞中的分布情况，具有高特异性和灵敏性。
4.1.3 血清中和试验 IHA（血清中和试验）被视为血清学诊断技术中的“金标准”，其原理是具有感染性的病原与中和抗体结合后失去感染力，通过倍比稀释血清抗体，最后计算可中和病原的最低血清稀释度，以此确定血清中是否存在特定病原的抗体及其中和能力。因此，该方法也是判定猪群免疫接种疫苗后对野毒抵抗力最准确的方法。对于PRV的IHA血清学诊断而言，可将具有感染性的特定病毒载量与血清在室温反应2 h后，将上清液接种于单层的PRV易感细胞（如猪肾上皮细胞，PK15），其后观察细胞是否会出现病变。如果细胞没有出现病变，则表明血清中存在PRV的中和抗体，如果有细胞病变，则代表血清中不存在针对PRV的中和抗体。但是，该技术不适用于区分PRV野毒感染或疫苗接种猪群，只能用于判断猪群是否产生针对病原的特异性中和抗体。
4.2 病原诊断技术进展
针对PRV-gE抗体的血清学诊断技术可用于快速区分野毒和疫苗毒株感染的猪群，但为进一步提升检测技术的多样性，越来越多针对PRV核酸的检测技术被研发出来，这些核酸检测技术都是在体外通过各种方法将特定核酸片段以指数式扩增后，借助不同的方法判定目的片段是否存在。其中最具有代表性的检测方法有聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（real-time PCR）、环介导等温扩增（LAMP）检测技术等。
4.2.1 聚合酶链式反应 PCR（聚合酶链式反应）方法具有操作简单、快速等特点，同时也具备很高的敏感性和特异性，该技术广泛应用于病原的核酸检测。对于PRV的核酸检测也是得益于PRV-gE基因缺失疫苗的使用，针对PRV-gE基因研发的核酸检测技术可区分疫苗感染和野毒感染。范克伟等[10]基于PCR法建立鉴别野毒感染的双重PCR核酸诊断方法，该方法可同时扩增PRV-gE（400 bp）和PRV-gB（582 bp），其检测敏感度可达10 pg/μL。由于当前生猪养殖过程中多种病原混合感染现象十分常见，因此也有研究人员基于PCR法开发了多种病毒同时检测的多重PCR方法。贵州大学Liu等针对6种常见病原（PRV、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪乙脑病毒）建立了多重PCR诊断方法，该技术对以上病原核酸的灵敏度分别为6.6 pg、96.0 pg、12.9 pg、10.5 pg、51 pg和46 pg，十分适合单个样品多种病毒的同时检测，极大地节省了时间和成本[11]。
4.2.2 实时荧光定量PCR技术 随着科研人员和养殖企业对病原诊断的便捷性和灵敏性要求越来越高，近年来越来越多检测中心或科研单位采用real-time PCR技术对病原进行检测，其检测原理与PCR类似，但较PCR技术的灵敏度和便捷性更高，因为该技术不需要对产物进行凝胶电泳，且可以通过计算机分析样品Ct值来初步判断样品中载毒量情况，这可以减少样品检测过程中的污染情况。当前绝大部分企业或单位都普遍采用商业化的real-time PCR试剂盒对PRV病原进行检测，当然也有部分院所自己研发相应的检测方法，且检测效果较为理想。侯月娥等基于PRV-gE基因建立了一种可用于检测PRV野毒的TaqMan荧光定量PCR方法，该方法对PRV野毒检测灵敏极限为100 copies/μL，是普通PCR法的100倍，该方法可用于检测野毒感染及PRV弱毒疫苗中是否存在野毒污染[12]。与多重PCR类似，也有研究人员建立了可同时检测PRV和其它病毒的多重real-time PCR检测方法，Tian 等曾建立可同时检测PRV野毒和PCV3的real-time PCR方法，该方法对以上两种病原的灵敏度极限分别为37.8 copies/μL和30.6 copies/μL，且同时检测两种病毒，则检测极限为60 copies/μL[13]。
4.2.3 环介导等温扩增（LAMP）检测技术 LAMP属于一种新型的核酸体外扩增检测技术，该方法的运行原理是恒温条件下（65 ℃左右）利用一对内外引物和Bst DNA聚合酶与模板形成哑铃状DNA，并以其为模板不断进行复制，该技术检测成本较低，操作方便，当前已广泛应用于多种病原的核酸检测。郑书轩等应用LAMP建立了一种PRV野毒的快速检测技术，该方法仅需1 h在65 ℃恒温条件下便可以对病原进行检测，且其灵敏度为1.0 copy/μL，较常规PCR技术更为敏感，且经过染色后可直接眼观观察结果[14]。然而，LAMP技术引物设计难度较大，检测灵敏度太高，在检测过程中容易出现假阳性问题。
对PRV核酸检测的技术远不止real-time PCR、PCR和LAMP这些方法，还有类似重组酶聚合酶扩增技术（RPA）、微滴式数字PCR法（ddPCR）等，且这些方法均表现出十分优秀的敏感性和特异性，但是，检测体系容易污染、检测成本高、需要特别的仪器设备等问题限制了其进一步的应用。值得注意的是，当前可以用二代测序（NGS）技术检测未知病原，虽然NGS技术可全面检测送检样品中所有的病原，且也有研究人员将该技术应用于PRV核酸检测[15]，但该技术检测成本高、耗时长，应用于猪场常规病原诊断较少，一般是用于科研机构或医院等单位。
4.2.4 病原分离结合其它实验室诊断技术 此外，对于病原诊断也有公认的“金标准”，即为病原分离结合后续系列鉴定。由于PRV可感染多种细胞，且很容易对病毒进行分离，目前已有很多科研机构将该病原分离出来。PRV的分离主要可分为以下几个步骤：将疑似或确定PRV感染的病料无菌处理（剪碎、匀浆、离心取上清液后无菌过滤）；
其后接种于单层易感细胞（如PK15细胞），直至出现明显病变；
最后收取上清液提取基因组DNA用于PCR检测，或使用IFA或IHA等技术对上清液中病原进行检测，或可将病毒富集后用于电镜观察病原形态，根据病原形态对其进行初步鉴定。但因病毒分离需要专业的仪器设备，检测时间长，对人员的专业水平要求较高，所以一般不适用于猪场对疫病的快速诊断。