林仕文，韩 锋，魏 玉，陈文传
药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)是指因各类化学药物、生物制剂、传统中药、天然药、保健品、膳食补充剂或辅料及其代谢产物所引发的肝功能异常和肝组织炎性改变，可导致患者发生急性肝衰竭，甚至需要肝移植或死亡，为全球肝病死亡原因的第5位[1]。国外流行病学资料显示，DILI年发病率约为19.1/100000，而我国人口基数庞大、临床药物品种多，人群普遍存在不规范用药现象，公众对药物安全性问题和DILI认知不足，增加了DILI发病率，人群年发病率预估为23.8/100000，远高于西方国家的报道[2,3]。DILI发病机制复杂，是多种机制先后或共同作用的结果，目前尚未充分阐明[4]。炎症和药物暴露的相互作用是DILI发病机制的重要假说之一。外源性炎症是DILI的易感因素，也是促进患者肝损伤加剧的重要因素。同时，药物或其代谢产物在体内药物代谢酶的作用下也可诱发肝内炎症应答，促进疾病发生和进展[5]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一种调节基因表达关键因子，广泛参与机体炎症和癌变等病理学过程[6]。在众多miRNA中，血清miR21和miR-124a水平在调控炎症和肝功能方面具有重要的作用。临床研究显示，非酒精性脂肪性肝病、慢性乙型肝炎、肝癌等多种肝脏疾病患者血清miR21和miR-124a水平均显著升高，表明miR21和miR-124a与肝脏疾病的发生、发展密切相关，可作为有效的生物标志物用于指导上述肝脏疾病的诊疗，但两者与DILI的关系及对病情判断的价值还有待阐明[7-9]。本研究采用实时荧光定量PCR法检测DILI患者血清miR21和miR-124a水平，旨在为临床诊疗提供生物学依据，现报道如下。
1.1 研究对象 2019年3月～2022年3月我院收治的DILI患者87例，男48例，女39例； 1.2 血清miR21和miR-124a检测 无菌采集外周静脉血5 ml，抗凝，12000 r/m离心处理10 min，取上清保存至-80℃冰箱待测。使用miRNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取miRNAs，再采用反转录试剂盒(日本Takara公司)反转录为cDNA。使用美国安捷伦MX3000PPCR仪采用实时荧光定量RT-PCR法扩增miR21和miR-124a目标片段，反应体系为20 μl，RT-PCR反应条件：①miR-21：95℃预变性10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共40个循环； 1.3 血生化指标检测 使用日本日立公司生产的7060型全自动生化分析仪检测肝功能指标； 2.1 两组肝功能指标比较 DILI发生后，DILI患者血清ALT、AST、GGT和TBIL峰值水平均显著高于对照组(P<0.05，表2)。 2.2 两组miR-21、miR124a mRNA、NF-κB和IL-6水平比较 在DILI发生后，DILI患者血清miR-21、miR124a mRNA、NF-κB和IL-6水平均显著高于对照组(P<0.05，表3)。 例数miR-21miR-124aNF-κB(pg/ml)IL-6(pg/ml)DILI发生前871.1±0.21.2±0.31069.4±315.83.8±0.9峰值871.4±0.3①2.6±0.4①3615.4±526.4①12.7±1.8①对照组601.0±0.11.1±0.1692.2±144.63.4±0.7 2.3 不同临床分型DILI患者血清指标比较 肝细胞型、胆汁淤积型和混合型DILI患者血清miR-21和miR124a mRNA水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，混合型DILI患者血清NF-κB和IL-6水平显著高于肝细胞型或胆汁淤积型(P<0.05，表4)。 肝脏是人体药物代谢的重要器官，也是药物毒性产物生成的主要场所，因此易产生药物性损伤。通常，DILI在用药5～90天内发病，多数急性患者并无特异性的临床表现，仅有肝脏生化指标不同程度的升高，部分患者可出现乏力、恶心、呕吐、食欲减退等症状[11]。目前，尚无金标准诊断DILI，仍属排他性诊断[12]。本组DILI患者血清ALT、AST、GGT、TBIL升高。近年来，临床仍在积极寻找某些特异性的预测因子，以期能够尽早发现DILI，实现早期治疗，但结果并不理想[13]。 DILI发病机制复杂，主要包括药物的直接肝毒性和特质性肝毒性。药物的直接肝毒性可引起免疫和炎症反应等肝损伤机制； miRNA是一组高度保守的内源性单链非编码小分子RNA，是调节基因表达的关键因子，其水平具有时空特异性和组织特异性。通过调控人体三分之一以上的基因，miRNA参与细胞生长和分化的生理过程，可反映正常细胞和组织的基础生理状态。miRNA也参与炎症、氧化应激、癌变等病理学过程，与多种疾病的发生、发展密切相关[16,17]。此外，临床研究发现，miR耐RNA酶降解，在外周血中具有可检测到的稳定水平。血清mRNA可能反映细胞的病理学状态，故可将血清miR作为新型生物标志物指导临床诊疗[18]。在众多miRNA中，miR-21是参与细胞增殖、血管生成、炎症反应、病毒感染等过程的多功能miRNA，可通过多种靶标参与疾病的发生和发展，其血清水平在多种肿瘤组织异常升高，在乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌等多种癌症发生过程中发挥着类似于癌基因的作用[19]。miR-124a广泛表达于神经细胞、肝细胞、免疫细胞等组织细胞，对T细胞的增殖、分化和生长具有调控作用，与细胞内炎症反应密切相关[20]。已有研究指出，miR-124a可通过靶向作用于机体炎症因子而参与肝脏疾病的发生和发展，这一机制也为肝脏疾病的临床诊治提供了新的靶点[21]。因药物代谢引起的炎症反应是DILI发生的重要机制之一，而与多种肝脏疾病发生有关的miR21和miR-124a均具有炎症调节作用，故检测两者的血清变化有一定的临床意义。 本研究分析DILI患者血清miR21和miR-124a水平变化，结果显示它们相对水平的峰值与血清NF-κB和IL-6峰值水平一致，较健康人均显著升高。miR-21的基因启动子区中包含4种核因子kapp-B的反应结合元件，可能通过NF-κB信号通路参与了DILI发生的炎症过程[22]。miR-124a则能够调控机体炎症反应，参与肝脏疾病的发生发展。有研究指出，MicroRNA-124a可负性调节糖皮质激素受体α，使其表达降低，同时调节IL-6等炎症因子水平随miR-124a表达增加而升高，从而加重肝病患者肝衰竭和对糖皮质激素的抵抗[23]。本研究进一步分析不同临床分型DILI患者各检测指标水平变化，结果显示，仅混合型DILI患者血清NF-κB和IL-6水平显著高于肝细胞型和胆汁淤积型，而miR-21和miR124a mRNA水平并无显著性差异，提示血清NF-κB和IL-6水平可为不同临床分型的DILI诊治提供一定的参考依据，而血清miR-21和miR124a mRNA水平的临床意义仍需要进一步研究。
年龄为25～64岁，平均年龄为(41.9±8.6)岁。DILI诊断符合《药物性肝损伤诊治指南》的标准[10]，DILI发生时间均为用药后6个月内，引起肝损伤的药物包括抗结核药31例、中草药26例、抗生素18例、化疗药物8例和其他药物4例；
DILI肝细胞损伤型67例、胆汁淤积型11例和混合型9例。排除标准：(1)用药前存在病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、自身免疫性肝病、肝硬化和肝豆状核变性；
(2)合并恶性肿瘤；
(3)营养不良；
(4)大量饮酒；
(5)有严重的心、脑、肾疾病或精神病。另选择同期60例健康人作为对照组，男37例，女23例；
年龄为28～61岁，平均年龄为(40.6±7.8)岁，不饮酒。按照《药物性肝损伤诊治指南》临床分型标准和肝损伤分级，肝细胞损伤型：血清谷丙转氨酶(ALT)≥3 ULN，且R≥5；
胆汁淤积型：碱性磷酸酶(ALP)≥2 ULN，且R≤2；
混合型：ALT≥3 ULN，ALP≥2 ULN，且2
2级(中度)：血清alt或alp升高，tbil≥34.2 μmol l，或虽无tbil升高但inr≥1.5；
3级(重度)：血清alt或alp升高，tbil≥85.5 μmol l，伴或不伴inr≥1.5；
4级(急性肝衰竭)：血清alt或alp升高，tbil≥171 μmol l或每日上升≥17.1 μmol l，inr≥1.5或pta<40%，可同时出现(1)腹水或肝性脑病；
(2)或与dili相关的其他器官功能衰竭；
5级(致命)：因dili死亡或需接受肝移植方可生存。患者或其家属均已签署知情同意书，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。< p>
②miR-124a：95℃预变性5 min，95℃ 45 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s，共40个循环；
72℃ 10 min。引物设计及合成均由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列见表1。以U6 snRNA为内参基因，计算目的基因水平相对于内参基因U6的比值，以2-△△ct表示miR21和miR-124a相对水平。
采用ELISA法检测血清核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和白介素-6(interleukin，IL-6，上海酶联生物科技有限公司)水平。
特质性肝毒性涉及药物及其活性代谢产物诱导的肝细胞线粒体受损、免疫应答、炎症反应、氧化应激等机制[14,15]。