黄 金，肖信锦，王慧娟，孙雪菲，邓扬悟,2*
（1 国家离子型稀土资源高效开发利用工程技术研究中心 / 江西离子型稀土工程技术研究有限公司，江西 赣州 341000；
2 江西理工大学，江西 赣州 341000；
3 江西应用技术职业学院，江西 赣州 341000）
离子型稀土矿开采早期，主要采用池浸和堆浸工艺，要求剥离地表土壤，对矿体进行开挖，每生产1 t稀土，就要破坏地表植被160～200 m2，剥离地表土达 300 m3，形成尾砂 1000～1600 m3[1–2]。以赣州地区为例，稀土开采遍布赣州18 个县(市、区)，涉及废弃稀土矿山302 个，遗留的尾矿1.91 亿t，因为离子型稀土开发，造成了大约97 km2的荒漠化土地。此外，浸矿过程中长期、大量使用硫酸铵溶液，使废弃矿区土壤理化性质遭到严重破坏，矿区动植物基本消失，水土流失极其严重，严重影响当地生态环境安全[3–4]。
植被恢复技术常被用于各种废弃矿区的生态修复[5–6]，然而，离子型稀土废弃地土壤立地条件十分恶劣，存在土壤偏酸性、营养元素缺失、透气性及水土保持能力差等问题，即使经过物理修复或添加化学肥料等方式的土壤改良，植物依然难以长期稳定生长，植被恢复的效果差[7]。
丛枝菌根 (arbuscular mycorrhiza，AM)真菌几乎能与陆地上80%以上高等植物根系形成有益共生体，已有的研究结果表明，在AM真菌与宿主植物的共生关系中，AM真菌在利用宿主植物的光合产物来满足自身生长繁殖需要的同时，能促进宿主植物对水分和矿质元素的吸收，提高宿主植物抗胁迫的能力[8–12]。目前，借助菌根技术调控退化生态系统，许多矿区的土地生产力得以恢复，生态环境得以改善。然而，这类真菌在离子型稀土矿山废弃地的生态重建中的作用效应研究鲜见报道。此外，黑麦草(Lolium perenne L.)作为优良的禾本科植物具有生长速度快、产量高、生长季节长、适应性广等特点，常作为修复植物应用于废弃场地的生态重建[13–14]。
基于此，本试验以离子型稀土矿山废弃地土壤为供试材料，以黑麦草为宿主植物，通过研究3种AM真菌(Glomus mosseae、Rhizophagus intraradices和Glomus etunicatum)对土壤改良和植物生长、抗干旱等方面的影响，探讨AM真菌对离子型稀土废弃矿区生态修复的作用效果，以期为离子型稀土废弃矿区加速生态修复实践提供理论依据和技术支撑。
1.1 供试材料
供试菌种为摩西斗管囊霉(Glomus mosseae，G.m)、根内根孢囊霉(hizophagus intraradices，R.i)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum，G.e)，3种AM真菌均购自于北京市农林科学院植物营养与资源研究所“丛枝菌根真菌种质资源库”(BGC)，接种剂为以三叶草作为宿主扩大繁殖获得的含孢子、被侵染根段及根外菌丝的沸沙混合物，接种剂量为100 g/盆。
供试植物为市购黑麦草种子，用10% H2O2消毒10 min，然后用纯水冲洗干净残留双氧水，用水浸泡 12 h 催芽。
供试土壤为赣州定南某离子型稀土矿堆浸后留下的尾砂土壤，自然风干过0.25 mm筛，160℃高温灭菌，土壤理化性质分析结果表明，该土壤pH仅为4.24，为酸性土壤，土壤中全氮、全磷和全钾含量分别为0.179、0.161和57.5 g/kg，碱解氮、有效磷和速效钾含量分别为48.3、0.76和69.7 mg/kg，土壤有机质含量为0.727 g/kg，均显著低于正常土壤水平。
1.2 试验设计
试验设置4个处理，分别为灭菌尾砂土壤上接种G.m、R.i或G.e 菌剂，以不接种菌剂为对照(CK)，每个处理6次平行重复，共24盆。每盆装1.5 kg风干土，接种菌剂量为100 g/盆，播50颗催过芽的黑麦草种子。播种完毕后在室内培养，保持良好通风，光照时间为14 h/d。播种后第7天进行间苗，每盆保留25株长势良好且一致的幼苗。前4周每周喷洒一次改良后的Hoagland营养液[15]，每次喷适量(100 mL/盆)，后续视土壤干湿和植物生长情况适量补充水或营养液，黑麦草总生长时长约7个月(210 天)。
1.3 样品采集与测定
分别在黑麦草生长的第10、20、30、45、75、115、155、195天，每盆选取15株黑麦草用卷尺量取株高，取平均值记录黑麦草株高。
在黑麦草生长的第195天，每个处理组收获3盆，取植株样分析养分含量、根系侵染率、植株地上部及地下部干重，取土壤样品分析理化性质。剩下的3盆进行抗干旱试验，不喷洒水，在室温(24℃～35℃)下自然干旱，分别在干旱胁迫的第0、2、4、6天取黑麦草叶片，检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和脯氨酸含量。
新鲜黑麦草根系侵染率用墨水醋染色法检测[15]。黑麦草洗净处理后，分为地上部和地下部，105℃杀青30 min，再于70℃下烘干至恒重，用天平称量得地上部及地下部平均干重[16]。黑麦草全氮采用开氏法测定，全磷采用硫酸消煮—钼锑抗比色法测定，全钾采用硫酸消煮—钼锑抗比色法测定[17]。黑麦草叶片SOD活性用氮蓝四唑(NBT)光还原法进行测定，脯氨酸含量用比色法进行测定[18]。
试验初始土壤和黑麦草生长195天后的根际土壤阴干后过2 mm筛，参照相关标准检测土壤pH、有机质、全氮、全磷、全钾以及碱解氮、有效磷和速效钾[19–26]。
1.4 数据处理
采用 Microsoft Excel 2003、SPSS 25.0 进行数据处理与统计分析。采用origin软件作图。
2.1 不同AM真菌对黑麦草根系的侵染
3种AM真菌对黑麦草的侵染率具有较大差异，其中G.m侵染率最高为70.17%，R.i次之为65.17%，G.e仅为46.83%，G.m和R.i侵染率显著高于G.e(图 1、图 2)。
图1 AM真菌侵染黑麦草根系情况Fig. 1 Infection of AM fungi on ryegrass root system
图2 AM真菌对灭菌废弃地种植的黑麦草根系的侵染率Fig. 2 Infection rate of AM fungi to ryegrass root planted in sterilized abandoned soil
2.2 AM真菌对废弃矿区土壤养分供应的影响
由表1可知，相比于不接菌空白组，接种AM真菌的根际土壤pH由强酸性(4.60)提高至7.62～7.90，有利于植物的生长；
G.m、R.i、G.e组土壤有机质含量分别提升了123.9%、126.8%、105.0%，3个真菌处理间无显著差异；
接种G.m和R.i真菌显著提高了土壤中全氮、碱解氮、全磷和速效钾含量，G.m组全氮、碱解氮和全磷的提升最高，分别提升了64.17%、59.93%和84.12%，R.i真菌组速效钾含量的提升最高，速效钾含量提高了73.31%，G.e对土壤全磷和全钾含量的增加未达到显著水平，3个真菌对有效磷和全钾含量的提升也未达到显著水平。
表1 AM真菌对土壤理化性质的影响Table 1 Effects of AM fungi on soil physicochemical properties
2.3 AM真菌对植物生长的影响
2.3.1 AM真菌对株高的影响 植株株高能直观表征植株的生长状况，也能间接反映植株生物量的累积。在黑麦草生长初期，特别是在生长20天以内，接种了AM真菌组与未接菌空白组对比，黑麦草株高没有明显区别(图3)，主要因为此时是黑麦草的幼苗期，根系刚刚发育，AM真菌尚未侵染或者侵染程度较低，菌根促进生长的效应尚未显现。随着种植时间延长，在黑麦草生长115天后，接种G.m和R.i真菌的黑麦草株高显著高于未接菌的空白组，表现出了很好的促进植物生长的效应，接种G.e真菌的黑麦草略高于未接菌的空白组，未达到显著性水平 (图 4)。
图3 接种不同AM真菌下黑麦草株高的生长动态Fig. 3 Effects of AM fungi on plant height of ryegrass
图4 接种不同AM真菌对黑麦草株高的影响Fig. 4 Plant height of ryegrass as affected by AM fungi
当黑麦草生长到195天时，AM真菌促进生长的效应进一步体现(图5)，接种3种AM真菌的黑麦草株高均显著高于未接菌空白组，接种G.m、R.i和G.e真菌组分别比未接菌的空白组高了38.13%、34.53%和25.33%。
图5 生长195天的接种不同AM菌剂的黑麦草长势Fig. 5 The growth of 195-days ryegrass under soil inoculated with different AM fungi strains
由上所述，通过监测黑麦草的长势，发现接种AM真菌可有效促进植株生长。在生长初期效果不明显，但随着生长时间延长，在生长的后期开始显现显著的促生效果，相比未接菌空白组，接种G.m、R.i和G.e真菌组株高分别增加了38.13%、34.53%和25.33%，其中G.m和R.i真菌促生效果更好。
2.3.2 AM真菌对植株干重的影响 由图6可知，土壤接种3种AM真菌均显著提高了黑麦草的地上部干重(P<0.05)，其中接种G.m真菌和R.i真菌更为显著，均比未接菌空白组高43.73%，且二者地上部干重也显著高于接种G.e真菌。接种G.m真菌和R.i真菌可显著提高黑麦草的地下部干重，其中接种G.m真菌促进作用最大，比未接菌空白组高64.68%。G.e处理根部干重的增加未达显著水平。
图6 生长195天的黑麦草地上及地下部干重Fig. 6 Dry weight of shoot and roots of ryegrass after 195 days of growth
2.4 AM真菌对植株营养元素的影响
由表2可见，相较于未接菌空白组，G.m和R.i及G.e处理显著提高了地上部氮磷钾含量。R.i处理还显著提高了地下部氮磷钾含量，较未接菌空白组分别提升了58.60%和83.27%、45.60%；
G.m和G.e也显著提升了地下部的氮磷钾含量，但是提升幅度低于R.i。总体看，接种AM真菌显著提高了植株地上部和地下部的氮磷钾养分吸收量，提高效果尤以R.i真菌显著。
表2 AM真菌对黑麦草营养元素含量的影响Table 2 Effects of AM fungi on nutrient element contents of ryegrass
2.5 AM真菌对植株抗旱性的影响
2.5.1 AM真菌对植株SOD活性的影响 图7表明，在正常水分条件下(干旱胁迫第0天)，各处理组SOD活性都较低，其中接种G.e真菌组活性最低，接种R.i真菌组活性最高；
干旱胁迫2天后，土壤中的水分部分蒸发，此时表土水分较为干燥，但底层土壤还比较湿润，各处理组SOD活性均有不同程度提高，其中接种G.m组和G.e组SOD活性分别提高了19.74%和19.34%；
当干旱胁迫4天后，因为室温较高(白天温度30℃～35℃)，土壤水分大量蒸发，各处理组SOD活性急速升高，但接种G.m、R.i和G.e 3种AM真菌组SOD活性分别高于未接菌空白组7.35%、15.94%和4.68%，均达到显著水平，其中接种R.i组活性最高；
当干旱胁迫6天后，此时土壤非常干燥，黑麦草叶片干枯变黄，可能极度的水分胁迫下，植株受损，产生SOD的能力降低，此时不同处理组SOD活性均出现不同程度地降低，但接种了AM真菌的黑麦草SOD活性依然显著高于未接菌空白组。
图7 AM真菌对干旱条件下黑麦草SOD活性的影响Fig. 7 Effects of AM fungi on SOD activity of ryegrass under drought condition
在干旱胁迫下，接种AM真菌有利于植物产生更多SOD从而提高植物的抗水分胁迫能力，特别是在环境干旱较为严重时(干旱胁迫第4、6天)，接种3种AM真菌组SOD活性都显著高于未接菌空白组，表现出了较强的抗干旱能力，但环境水分胁迫不能过强，当极度干旱时(干旱胁迫第6天)，植株严重缺水，出现枯黄，不论是否接种AM真菌，SOD活性都会降低。
2.5.2 AM真菌对植株脯氨酸含量的影响 图8显示，在正常水分(干旱胁迫第0天)条件下，各处理组脯氨酸含量均较低；
当低度缺水条件下(干旱胁迫第2天)时，黑麦草体内脯氨酸含量大量增多，但各处理组之间相差相对较小，只有接种R.i组与未接菌空白组达到了显著性差异，但脯氨酸含量也仅高6.88%；
当严重缺水条件时(干旱胁迫第4天)，黑麦草中脯氨酸急剧升高，相比正常水分条件下，未接菌空白组提高了3.41倍，接种AM真菌组最高提高了4.64倍，此外，接种AM真菌组脯氨酸含量显著高于未接菌空白组，接种G.m、R.i和G.e组分别提高了34.94%、36.66%和16.87%，表现出了良好的抗水分胁迫能力；
当极度缺水条件(干旱胁迫第6天)下，此时各处理组脯氨酸含量均有所降低，但接种AM真菌组依然显著高于未接菌空白组，此时接种R.i组脯氨酸含量最高，比未接菌空白组高42.92%。
图8 AM真菌对干旱条件下黑麦草脯氨酸含量的影响Fig. 8 Effects of AM fungi on proline content of ryegrass under drought condition
接种AM植物可产生更多的脯氨酸从而提高抗水分胁迫能力，尤其是在严重缺水(干旱胁迫第4天)和极度缺水(干旱胁迫第6天)时3种AM真菌均能显著提高脯氨酸含量，其中接种R.i真菌组脯氨酸含量最高，抗缺水胁迫能力最强。
3.1 AM真菌可改良离子型稀土废弃矿区土壤
离子型稀土废弃矿区土壤为剥离表土后的“生土”，土壤生物活性较低。根据前文土壤理化性质指标分析结果可以发现，该土壤有机质含量特别低，营养元素缺失，再加上池浸、堆浸工艺过程中长期被偏酸性的硫酸铵溶液浸泡，大量的离子被淋失，导致土壤立地条件进一步恶劣。
参照绿化种植土壤标准[27]，一般植物对pH的要求为5～8、有机质为12～80 g/kg、碱解氮为40～200 mg/kg、有效磷为 5～60 mg/kg、有效速为 60～300 mg/kg。对比可知，离子型废弃矿区土壤呈酸性，有机质含量极低，氮、磷、钾 3种元素含量均偏低。因此，离子型稀土废弃矿区生态修复首要解决的问题就是矿区土壤的改良。目前，离子型稀土废弃矿区土壤改良措施主要有客土覆盖以及施加石灰、化肥等改良方法[28]，但客土覆盖措施工程量大、费用高，难以大面积实施，而施加石灰降低土壤酸度、施加化肥改良土壤营养则存在时效性低的不足，停止施加后土壤pH、植被覆盖度、物种数和生物量都会显著下降[29]，难以从根本上解决土质差的问题，进而导致植被恢复的长期效果较差。
AM真菌能够侵染宿主植物根系，在根系皮层内形成菌丝、丛枝、泡囊、孢子以及辅助细胞等结构，同时菌丝又可向根外延伸，最长可达10 cm以上，延伸过程中遇到其他根系时能够继续侵染，从而在根系之间形成致密的菌丝网络[30]。AM菌丝体活动影响根系的分泌作用，可调节根系土壤pH的变化[31]，这可能是本研究中土壤pH由酸性转为中性的原因之一。同时，本研究中AM真菌侵染黑麦草根系后，在土壤中形成巨大的菌丝网络，而菌丝网络能够分泌磷酸酶，增加磷酸酶活性[32]，对于极度缺乏磷的离子型废弃矿区土壤，能够极大促进土壤中难溶性磷的转化，提高有效磷含量。另外，菌丝网络能够将土壤本身的营养物质以及施加的Hoagland营养液[15]中的营养物质同化到菌丝体中，从而把这些物质吸收、转化到根际土壤中，促进土壤“肥沃岛”的发育和形成，这也使得离子型稀土废弃矿区土壤氮、磷、钾等营养物质大幅度提升，在矿山复垦的试验研究也表明，AM真菌能够加速土壤肥力的改良[33]。此外，AM真菌菌丝体及孢子较易腐烂，可向土壤输入有机质[34]，这可能是接种AM真菌后离子型稀土废弃土壤有机质含量是未接菌空白组1.27倍的主要原因。由上，利用AM真菌可改良离子型废弃矿山土壤，为植被恢复创造有利条件。
3.2 AM真菌促进植物生长
离子型稀土废弃矿区是砍伐树木、剥离表土后的遗留地，局部已呈荒漠化，生态修复迫在眉睫。植被修复是实现离子型稀土矿废弃矿区生态修复的重要途径，但目前植被修复的效果并不理想。大量研究表明，AM真菌侵染宿主植物形成共生关系后，大量的菌丝延伸到植物根际土壤中，扩大根系对土壤氮、磷、钾等元素的吸收范围，增强对矿质元素的吸收能力，从而改善植物的营养状况，促进植物生长[35]。
本研究中，接种AM真菌的黑麦草株高显著高于未接菌空白组，其中G.m和R.i真菌促进生长效果最好，相比未接菌空白组分别增加了38.13%和34.53%；
3种AM真菌均能显著提高黑麦草的干重，其中接种R.i真菌黑麦草地上部干重比未接菌空白组高43.73%，接种G.m真菌黑麦草地下部干重比未接菌空白组高64.68%；
3种AM真菌均能显著提升黑麦草对氮、磷、钾等养分的吸收量，其中接种R.i真菌黑麦草地下部全磷含量提升了83.27%。这表明接种AM真菌可显著促进植物生长和对养分的吸收，研究结论与王海娟等[36]一致。
3.3 AM真菌提高植物抗干旱能力
离子型稀土废弃矿区在长期的环境侵蚀下土壤结构受到严重破坏，持水性、透气性较差，与沙化土壤性质相似，干旱是主要胁迫。AM真菌通过庞大的菌丝网络能够扩大植物根系对水分的吸收，把更远更深处的水分传递给植株，从而调节水分代谢。在干旱季节，AM真菌能够增加植物水分通量[37–38]，而剪短AM菌丝后则会显著地缩减植物根系对土壤水分的传递范围[39]。同时，AM真菌还能通过分泌球囊霉素促进土壤团聚体形成，从而提高土壤的保水能力，缓解水分胁迫对植物的影响[40]。此外，AM真菌还能通过调节植物矿质营养元素[41]、改变植物体内激素平衡[42]、提高保护酶活性[43]等，调控植物抗旱的生理生化过程，影响宿主植物对水分的吸收和利用，提高植物抗干旱能力。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物体内重要的抗氧化酶系，在逆境环境下，植物体内的超氧阴离子自由基的产量增加，对细胞产生伤害，而SOD可以有效清除超氧阴离子自由基，降低伤害[44]。脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，易与水合或具有较强的水合力，植物受到水分胁迫的时候，植物会通过合成大量的脯氨酸等有机溶质提高细胞渗透势，利于细胞或者组织的持水，有助于提高抗干旱能力[45]。因此SOD活性和脯氨酸含量大小可以反映植物抗水分胁迫的能力。本研究中，在严重缺水胁迫下，接种AM真菌的黑麦草通过分泌更多的脯氨酸利于细胞持水，又通过提高黑麦草中SOD活性清除超氧自由基，进而缓解干旱对黑麦草细胞的伤害，显著提升植物抗干旱胁迫能力，这与Samiappan等[46]、Huang等[44]的研究结果一致。
在离子型稀土废弃矿区土壤上接种3种AM真菌，均能有效侵染黑麦草根系，提高黑麦草植株的耐旱性，有利于黑麦草植株产生更多的SOD和脯氨酸以提高抗干旱胁迫能力。接种AM真菌可显著提高离子型稀土废弃地上黑麦草根际土壤pH，提高土壤有机质、全氮、全磷和速效氮、钾含量，显著增加植株株高和地上及地下部干重生物累积量。因此，接种AM真菌有利于提高离子型稀土废弃矿区的生态修复效果，尤其是G.m和R.i两种真菌有非常可期的推广前景。
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