孙靖辉，林 豪，王 阔，曾钦成，李 贺，王春梅，陈建光
(北华大学药学院，吉林 吉林 132013)
代谢相关脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)作为一种与肥胖、高血脂及代谢综合征密切相关的慢性疾病，已成为严重的全球性公共卫生问题[1].然而，目前尚无药物被批准直接用于MAFLD的治疗，临床上主要是通过减少MAFLD相关的危险因素来达到治疗目的.中药治疗MAFLD具有独特的优势，研究[2]表明，中医药能有效改善胰岛素抵抗，降低肝脏脂质沉积和减轻肝脏炎症.
五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，作为我国代表性补益类药物已应用2000余年[3].五味子的有效活性成分包括木脂素、多糖和挥发油等，其中木脂素(Schisandrachinensislignans，SCL)是五味子主要的活性成分，有治疗肝损伤、慢性咳嗽、平喘、镇静、抗衰老及神经保护等功效[4-6].然而，对于五味子治疗MAFLD的具体成分尚不明确，其肝脏保护机制还有待进一步阐明.
如果运用传统的研究手段筛选五味子治疗MAFLD的有效成分，实验样本量巨大，研究周期较长，也很难在MAFLD复杂的发病机制中确定五味子的潜在作用靶点.根据SCL在大鼠体内的分布[7]显示，在肝脏中检测出12种SCL原型成分，如戈米辛J、五味子醇乙、五味子酚等.因此，本研究通过网络药理学筛选肝脏中12种SCL原型成分治疗MAFLD的核心成分和关键靶点，再通过分子对接技术模拟核心成分和关键靶点的结合情况预测五味子治疗MAFLD的作用靶点及机制.
1.1 网络药理学分析
1.1.1 成分靶点预测
表1 口服五味子总木脂素后在肝脏中检测到的12种SCL
1.1.2 疾病靶点预测
1.1.3 治疗MAFLD的作用靶点筛选及蛋白质-蛋白质相互作用网络图的构建
1.1.4 成分-交集靶点网络图的构建及富集分析
1.2 分子对接验证
2.1 网络药理学的靶点筛选和富集分析
通过TCMSP数据库检索，将得到的靶点进行合并，除去重复项，最终得到与12种SCL原型成分相关的1361个靶点.通过MAFLD的靶点筛查后，得到相关靶点627个，其中，五味子木脂素和MAFLD交集靶点共226个(见图1).
图1五味子与MAFLD的韦恩图Fig.1Venn diagram of potential target of Schi- sandra chinensis and treating MAFLD
将226个交集靶点导入到String网络中构建交集靶点网络模型(见图2).图中共有222个节点、4636条边，平均节点度值为41.8.图3为根据度值排名构建PPI网络的核心基因直方图，结果提示，Akt1和PPAR-γ可能是五味子治疗MAFLD的关键靶点.
图2交集靶点的PPI网络Fig.2Protein-protein interaction network of intersection target
图3PPI网络中的核心基因Fig.3Histogram of core genes in PPI network
图4为成分与交集靶点之间的关系网络图，结合成分靶点预测结果，提示五味子酯乙、五味子乙素、五味子甲素、五味子酚、五味子醇乙、戈米辛J和当归酰戈米辛H是与Akt1较为密切的活性化合物；
五味子酯乙、五味子乙素、五味子甲素、五味子酚、五味子醇乙、戈米辛J是与PPAR-γ较为密切的活性化合物，并在接下来的分子对接实验中进行验证.
图4成分-交集靶点网络Fig.4Component-intersection target network
在GO富集分析中，共获取99个GO条目，其中生物过程(BP)条目42个(主要包括对脂蛋白颗粒的反应、细胞对脂蛋白颗粒刺激的反应、脂肪酸氧化的调节等)，细胞组成(CC)条目17个(主要包括睫状基体、RNA聚合酶II转录因子复合物、核转录因子复合体等)，分子功能(MF)条目40个(主要包括蛋白磷酸酶结合、磷酸酶结合、DNA结合域等)(见图5).在KEGG富集中，共获得40条通路，主要涉及长寿调节途径、AMPK信号通路、破骨细胞分化、癌症通路等.最后将P值较小的前5个GO条目和前10个KEGG通路进行可视化分析(见图6).
MF.分子功能；
CC.细胞组成；
BP.生物过程.图5五味子活性成分治疗咳嗽的GO富集分析Fig.5GO enrichment analysis of active components of Schisandra chinensis in treating cough
图6关键靶点的KEGG通路富集分析Fig.6KEGG pathways enrichment analysis of key targets
2.2 分子对接模拟结果
分子对接结果显示：Akt1和PPAR-γ与其对应成分的结合能均小于-5.0 kJ/mol(见表2)，表明成分与靶点具有较好的结合活性[8].然后将成分与靶点的对接结果在Pymol 1.8中进行可视化分析，结果见图7.以五味子酯乙分别与Akt1和PPAR-γ靶点蛋白对接为例，分析其与受体之间可能存在的作用模式，五味子酯乙与活性位点附近的GLU-198、ASP-292、THR-160氨基酸残基形成氢键结合到Akt1，与活性位点附近的SER-342氨基酸残基形成氢键结合到PPAR-γ.
表2 五味子核心成分与关键靶点的对接能量Tab.2 Docking energy between key components of Schisandra chinensis and key targets
图7与MAFLD相关的五味子核心木脂素与关键靶点的分子对接模式Fig.7Molecular docking pattern of key components of Schisandra chinensis and key targets related to MAFLD
随着人们饮食结构、生活方式的改变，MAFLD的发病率逐年上升，并呈现低龄化趋势，严重威胁人民的健康[9].肝脏作为机体物质代谢的中枢，主要涉及胆汁分泌、解毒排泄、生物代谢与转化、凝血因子合成及免疫等多种重要的生物过程，其代谢转化与吞噬解毒功能对机体有重要的保护作用[10].现代医学主要通过保肝、降酶、降脂、调节免疫等方法治疗MAFLD，但治疗效果欠佳，存在停药反弹现象，且不良反应大[11-12].中医具有明显的治疗优势，能为患者提供个性化治疗方案，有效改善临床症状[13].
在MAFLD的研究中，五味子总木脂素显示出显著的治疗作用，不但能够调节高脂动物模型的脂质代谢紊乱，还可以缓解肝脏炎症损伤和脂质过氧化[14-16]，但具体的活性成分和作用机制则未能明确.本研究通过TCMSP平台筛选12种SCL原型成分相关的1361个靶点，再利用TTD、DisGeNET和 DrugBank数据库收集MAFLD相关靶点共627个.比对成分靶点与疾病靶点得到226个交集靶点，通过构建PPI网络图及拓扑分析进一步得到Akt1和PPAR-γ两个关键靶点.成分靶点筛选和成分-靶点网络图结果显示五味子酯乙、五味子乙素、五味子甲素、五味子酚、五味子醇乙、戈米辛J和当归酰戈米辛H可能是五味子治疗MAFLD的核心成分.分子对接结果表明，核心成分与关键靶点之间对接紧密，具有较强的亲和力.
有研究[17]表明，人体内许多基因、分子、信号通路等均与肝脏疾病的发生、发展密切相关.长寿调节途径和AMPK信号通路是KEGG富集分析筛选得到的与MAFLD密切相关的信号通路，PI3K-Akt和NF-κB信号通路是其上游因子，而Akt1和PPAR-γ是这些通路中的重要因子.PI3K-Akt信号通路是经典的炎症信号通路，可调节细胞分裂、分化、迁移等生理过程，具有促进细胞生存、细胞自噬及抗凋亡的作用[18].Akt1在肝脏中广泛表达，但是肝脏中Akt1的过度抑制也可以诱发肝脏损伤[19-20].Akt1是AMPK的上游因子，能间接影响AMPK的表达.AMPK是一类重要的蛋白激酶，是细胞能量传感器，在葡萄糖及脂肪酸代谢方面都起到了关键的作用.AMPK信号通路与MAFLD、2型糖尿病等代谢性疾病有关，它能调节葡萄糖和脂肪酸的代谢，ATP缺乏可导致AMPK磷酸化激活，从而能够降低肝脏细胞脂肪含量，并减少甘油三酯的形成[21].PPAR-γ主要存在于免疫系统以及脂肪组织，能够调节机体免疫、胰岛素抵抗以及脂肪细胞分化[22].研究[23]表明，PPAR基因缺失可导致肝脏组织内脂质代谢发生紊乱，进而导致脂肪酸在肝脏组织内大量堆积，诱导肝脏组织发生脂肪变性，而PPAR-γ激活能减少大鼠骨骼肌内脂质积累及减轻脂肪肝模型小鼠的肝脏脂质积累，同时活化的PPAR-γ可以通过抑制NF-κB等转录因子的活性负向发挥转录调控的效应[24].在分子对接的验证中发现，五味子核心成分能通过氢键紧密地结合相关靶点蛋白，表现出较强的亲和力，提示五味子可能通过调控Akt1和PPAR-γ在信号通路中的表达以及炎症、脂质代谢等多途径发挥抗MAFLD的作用.
综上，本研究通过网络药理学分析方法预测了五味子在肝脏中原型成分治疗MAFLD的潜在靶点，探讨了五味子可能通过多靶点、多通路来调节肝脏脂质代谢、炎症反应等生物学过程，从而发挥治疗作用.本研究还运用分子对接技术验证了核心成分与关键靶点蛋白Akt1和PPAR-γ之间的结合活性，为后续进一步深入探究五味子治疗MAFLD的药理机制以及五味子药用资源的合理开发利用提供科学依据.
猜你喜欢五味子脂质靶点维生素D受体或是糖尿病治疗的新靶点中老年保健(2021年3期)2021-12-03肿瘤免疫治疗发现新潜在靶点中国生殖健康(2020年7期)2020-12-10HPLC-DAD法快速筛查五味子颗粒(糖浆)中南五味子代替五味子中成药(2018年12期)2018-12-29复方一枝蒿提取物固体脂质纳米粒的制备中成药(2018年9期)2018-10-09白杨素固体脂质纳米粒的制备及其药动学行为中成药(2018年1期)2018-02-02马钱子碱固体脂质纳米粒在小鼠体内的组织分布中成药(2017年4期)2017-05-17五味子醇甲提取纯化方法的研究进展中成药(2017年3期)2017-05-17北五味子化学成分的研究中成药(2017年3期)2017-05-17HPLC法同时测定五酯胶囊中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量药学研究(2015年11期)2015-12-19心力衰竭的分子重构机制及其潜在的治疗靶点医学研究杂志(2015年7期)2015-06-22