兰伟康，李 光，高保全，刘 萍，吕建建
（1.水产科学国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306；
2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室，山东 青岛 266071；
3.青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266235）
三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）隶属于甲壳纲十足目梭子蟹科梭子蟹属[1]，其生长性状呈现性二态型，且雌雄蟹的市场价格差异较大，实现单性养殖将有效提高养殖效益。甲壳动物性别决定类型复杂多样且性别决定机制尚不明确，但普遍认为促雄性腺（androgenic gland，AG）分泌的胰岛素样促雄腺激素（insulin-like androgenic gland hormone，IAG）可以调控雄性的性别分化[2]。
促雄性腺为雄性甲壳动物特有的内分泌器官，首次发现于蓝蟹（Callinectes sapidus）的输精管附近[3]。通过在跳沟虾（Orchestia gammarella）中的验证，发现促雄性腺具有调节雄性初级和次级性别特征分化的功能[4]。向雌性普通卷甲虫（Armadillidium νulgare）和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）中植入促雄性腺导致其发生雄性化[5,6]。此外，向雌性普通卷甲虫中注射促雄性腺活性提取物质同样可以导致其发生雄性化[7]，推测促雄性腺的某种分泌物在雄性甲壳动物的性别分化中发挥关键作用。后续发现该分泌物为胰岛素样促雄腺激素（IAG）[8]，并在普通卷甲虫中获得首个IAG基因的cDNA 序列[9]。随后，在红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）中鉴定到了IAG基因，其编码的氨基酸包括信号肽、B链、C 链和A 链[10]。之后IAG基因在包括罗氏沼虾、斑节对虾（Penaeus monodon）和拟穴青蟹（Scylla paramamosain）等十足目动物中得到鉴定和研究[11-21]。其中干扰罗氏沼虾IAG基因的表达会抑制初级精母细胞的发生和雄性第二性征的生长[11]。在此基础上，通过长期敲降IAG基因获得了伪雌虾，成功研发了罗氏沼虾性别控制技术[15]，这是目前为止在养殖甲壳动物中建立性别控制技术并成功应用于产业的唯一案例。
目前有关三疣梭子蟹IAG（PtIAG）基因研究报道，分析了PtIAG基因在组织中的表达模式，并验证了其参与胰岛素家族的信号传导系统，且受眼柄负调控[19]。但并未涉及PtIAG基因的结构以及启动子序列等分析，且该基因在幼体时期的表达模式也尚不清楚。本研究通过解析PtIAG基因的结构，分析其上游区域核心启动子的位置和潜在的转录因子结合位点。通过对PtIAG基因的转录本进行分析，发现其存在不同的剪切体，并系统分析其在幼体发育时期以及成体各组织中的表达模式，期望能为解析PtIAG基因在性别分化中的功能提供帮助，同时为建立三疣梭子蟹性控技术提供重要参考。
1.1 材料
三疣梭子蟹，养殖于山东省昌邑海丰水产养殖有限责任公司，实验材料包括不同发育时期的幼体和不同的成体组织，其中不同发育阶段的幼体材料7 个（溞状幼体4 个时期、大眼幼体和幼蟹2 个时期），不同成体组织材料9 个（脑、眼柄、鳃、肝胰腺、肌肉、卵巢、精巢、输精管和促雄性腺）。上述材料获取后立即置于液氮保存，用于后续的RNA 和DNA提取。
1.2 基因组DNA、总RNA提取和cDNA合成
使用Steady Pure 通用型RNA 提取试剂盒（AG21017，艾科瑞生物）对单个幼体进行DNA/RNA 共提取，详细操作步骤参考说明书。以幼体基因组DNA 为模板，使用三疣梭子蟹的性别标记[22]鉴定雌雄，随后每个时期均制备雌性和雄性高质量RNA 混合池各一个（每个混合池包含3 只个体）。使用Trizol 提取组织样品的总RNA，每种组织同样制备雌性和雄性高质量RNA混合池各一个（每个混合池包含3 只个体）。制备好的RNA 材料使用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒（TaKaRa，日本）进行cDNA 合成，利用核酸定量仪（NanoDrop 2000 Thermo Scientific）测定cDNA浓度。
1.3 甲壳动物IAG基因多序列比对和系统进化分析
为构建比较完整的甲壳类IAG基因系统进化树，利用NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索甲壳动物IAG基因序列，并整理为氨基酸序列。使用MEGA 7 软件（https://megasoftware.net）对氨基酸序列进行多重比对分析，并构建ML 系统进化树，检验参数设置Bootstrap，检验重复频率为500次，置信区间为95%，其他参数为默认值。
1.4 PtIAG基因的结构、可变剪切及启动子分析
基于PtIAG基因mRNA 序列（KX168425.1）与本课题组组装的三疣梭子蟹参考基因组，锚定PtIAG基因在基因组序列中的位置，进一步明确外显子和内含子区域。利用Primer Premier 5.0软件在PtIAG基因的外显子和内含子上设计特异性引物（表1），以三疣梭子蟹雌雄组织混合cDNA 为模板，采用普通PCR 和琼脂糖凝胶电泳检测是否存在不同剪切体。截取PtIAG基因上游3 000 bp 的序列，利用在线软件（http://www.fruitfly.org/seq_tools/nnppHelp.html）预测核心启动子和转录起始位点（TSS），利用在线软件https://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi? dirDB=TF_8.3）和（https://biogrid-lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/）预测转录因子识别位点。
表1 实验所用的引物序列Table 1 Sequence of primers used in the experiment
1.5 PtIAG基因表达模式分析
根据已知的PtIAG基因和三疣梭子蟹管家基因β-actin，利用Primer Premier 5.0 软件设计荧光定量特异性引物和内参引物（表1）。利用qPCR 技术对PtIAG基因进行相对表达量分析，每个样品设置3 次平行，反应体系为：Template cDNA 1 μL，ROXReference Dye II 0.2 μL，TB Green Premix Ex Taq II 5 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，RNase-free H2O 4 μL；
程序参照TaKaRa TB Green™Premix Ex Taq™II 进行。目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCT方法计算[23]，利用SPSS19.0 软件对数据进行方差分析，使用Origin软件进行柱状图绘制。
2.1 甲壳动物IAG基因多序列比对和系统进化
从NCBI 数据库中检索到29 种甲壳动物的IAG基因，其中包括4 种等足目动物和25 种十足目动物（表2）。氨基酸序列多重比对分析结果显示，在所有物种中存在6 个保守的半胱氨酸残基和1 个保守的络氨酸残基（图1）。为分析PtIAG基因与其他甲壳动物IAG基因之间的进化关系，构建了ML 系统进化树（图2），结果表明IAG基因的进化分类与物种的进化分类高度一致，十足目与等足目动物的IAG 基因分别聚为一支。在十足目中，虾类和蟹类的IAG基因又分别聚类在一起，PtIAG基因与其他蟹类IAG基因聚为1 支，表明亲缘关系越近的物种其IAG基因的进化关系也相对较近。
图1 甲壳动物IAG基因氨基酸序列多重比对Fig.1 Multiple alignment of amino acid sequences of IAG genes in Crustaceans
图2 IAG氨基酸序列ML系统进化树Fig.2 ML phylogenetic tree of IAG amino acid sequences
表2 甲壳类物种的IAG基因Table 2 IAG genes in crustacean species
2.2 PtIAG基因序列结构及启动子序列
通过锚定PtIAG基因在参考基因组上的位置，确定PtIAG基因的DNA 序列全长2 615 bp，包括4个外显子和3 个内含子，遵循GT-AG 剪切规律。截取PtIAG基因上游3 000 bp 的序列进行启动子序列分析，结果显示转录起始位点位于翻译起始密码子（ATG）上游第2 834 核苷酸(A)；
核心启动子区域位于-2 710～-2 660 bp，A/T 含量为60%；
在PtIAG基因启动子区域存在多个转录因子作用元件，包括SOX-5、SOX-9、GATA-1、FOXJ2、DSX、AP-1、STAT等识别位点（图3）。
图3 PtIAG基因及其启动子序列Fig.3 The gene and promoter sequence of PtIAG
2.3 PtIAG基因可变剪切分析
以雌雄混合组织cDNA 为模板，通过位于第1和第4外显子区域的引物进行PCR扩增和电泳进行可变剪切分析。结果显示电泳产物中存在两条目的条带，分别命名为PtIAG1和PtIAG2（图4）。将两种产物进行单克隆测序，序列比对发现PtIAG2比PtIAG1多254 bp 的插入，插入序列与内含子1 的序列相同，表明PtIAG2是通过内含子保留的可变剪切方式形成的（图5）。
图4 PCR产物Fig.4 PCR product
图5 PtIAG基因结构Fig.5 Gene structure of PtIAG
2.4 PtIAG基因表达模式
表达模式分析结果显示，在幼体发育时期，PtIAG基因在溞状幼体时期表达量最高，且呈现明显的雌雄差异。PtIAG1在溞状幼体Ⅰ期的相对表达量雌雄差异显著（P＜0.05），雄性的表达量是雌性的22.01 倍；
PtIAG2在溞状幼体Ⅰ期和溞状幼体Ⅱ期的表达量雌雄差异显著（P＜0.05），雄性的表达量分别是雌性的3.71倍和2.38倍（图6）。由图7可知，在成体组织中，PtIAG基因呈现多组织表达模式，其中在促雄性腺中表达量最高，尤其是PtIAG1，表达量为其余组织的千倍；
此外，PtIAG基因在其他组织中的表达也存在雌雄差异的情况，比如PtIAG1在雌性眼柄和肝胰腺中的表达量分别是雄性的57.21 倍和3.53 倍，PtIAG2在雄性的脑、肝胰腺中的表达量分别是雌性的2.72倍、3.34倍。
图6 PtIAG基因在不同幼体发育时期的相对表达量Fig.6 Relative expression levels of PtIAG gene at different developmental stages
图7 PtIAG基因在不同组织的相对表达量Fig.7 Relative expression levels of PtIAG gene in different tissues
促雄性腺作为甲壳类动物特有的器官，在性别分化等多种生理过程中具有重要功能[24-26]，而这些生理过程主要由IAG基因进行调节[15,27,28]。有关甲壳动物IAG基因系统进化树之前已有报道，当时可用于建树的IAG基因较少，一般仅包含10 余个基因[17]。本研究用于建树的甲壳动物IAG基因多达29个，数量显著高于之前的研究，能够更具体地了解不同物种IAG基因间的进化关系。氨基酸序列比对结果显示这些基因均存在6 个保守的半胱氨酸残基，该区域为形成二硫键的关键区域[14]，表明其在维持IAG基因的基本功能中具重要作用。
在一些甲壳动物中有关IAG基因结构的研究中，中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）和墨吉 明对虾（Fenneropenaeus merguiensis）中IAG基因由5 个外显子和4 个内含子构成[14,20,29,30]。本研究发现PtIAG基因由4 个外显子和3 个内含子组成，这与拟穴青蟹和美洲龙纹鳌虾（Procambarus νirginalis）中的IAG基因结构相同[17,31]。然而，PtIAG基因和SpIAG基因的长度更为接近，它们外显子2 和外显子3 的长度均相同，分别为133 bp和80 bp[17]。这一结果暗示着亲缘关系相近的甲壳动物其IAG基因的结构也可能更为相似。
转录因子可以与基因启动子区域上特定的位点相结合，从而调控基因的表达。在拟穴青蟹IAG基因的启动子区域预测到SOX-5、AP-1 和STAT 等转录因子的结合位点，经过双荧光素酶验证，发现转录因子SOX-5、AP-1 和STAT 均可以增强IAG基因的启动子活性[19]。其中SOX-5 是SOX转录因子家族的成员之一，该家族成员在性别决定与分化中具有重要功能[32]。本研究在PtIAG基因的启动子区域同样预测到了转录因子SOX-5、AP-1和STAT的结合位点，意味着这些转录因子有可能会调控PtIAG基因的表达。在三疣梭子蟹中敲降Dmrt家族的基因导致IAG基因的表达量显著下调[33,34]，而Dmrt家族的成员在哺乳动物的性别决定及分化过程中通常作为转录因子发挥调控作用[35]。本研究在PtIAG基因的启动子区域也预测到Dmrt基因家族的结合位点（DSX），表明三疣梭子蟹Dmrt家族可能通过与该位点结合，从而正向调控PtIAG基因的表达。
本研究通过对PtIAG基因进行可变剪切分析，发现其存在2 种转录本，其中PtIAG2为保留了内含子1 的可变剪切转录本。在其它甲壳动物中关于IAG基因可变剪切的研究已有报道，在中国明对虾中的IAG基因存在相同类型可变剪切，其保留了内含子4[14]。本研究对PtIAG基因的2 种转录本进行了组织表达模式分析，其主要表达于雄性的促雄性腺。然而，2 种转录本在促雄性腺中的表达量存在极显著差异，非内含子保留型的PtIAG1表达量较高，推测可能由其发挥主要功能。而在中国明对虾中内含子保留型的可变剪切转录本起主导作用[14]。此外，本研究开展了2 种转录本在溞状幼体至幼蟹共7 个发育时期的表达模式分析，发现PtIAG1和PtIAG2均显现雄性高表达的趋势，主要在溞状幼体时期表达。且2个转录本在幼体发育时期的表达模式相似，但在组织中的表达模式不尽相同。比如PtIAG1在雌性的眼柄、肝胰腺和卵巢中表达量较高，而PtIAG2仅在雌性眼柄中有较高表达量，暗示了2种转录本可能存在某些功能上的差异。整体而言，PtIAG1和PtIAG2无论在幼体发育时期还是成体时期，均显现明显的雄性偏向表达趋势，表明其在雄性分化及维持中发挥了重要作用。
本研究明确了PtIAG基因的结构，其由4 个外显子和3 个内含子组成；
预测了其启动子区域核心顺式作用元件，发现其启动子区域存在许多与性别分化相关的转录因子结合位点，包括DSX 和SOX-5等；
发现PtIAG基因存在2 种不同转录本，其中非内含子保留型的转录本发挥主导作用，并且两种转录本可能存在某些功能上的差异；
在溞状幼体至幼蟹共7 个发育时期的表达模式分析中发现，在幼体发育时期，PtIAG基因主要在溞状幼体Ⅰ期的雄蟹中表达；
在成体组织中，PtIAG基因主要在促雄性腺中表达。综上所述，PtIAG在三疣梭子蟹雄性分化及维持中具有重要作用。