姜山，孙阳，崔兆磊，吴巧铃，夏红梅
（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；
2.福建医科大学肿瘤临床医学院/福建省肿瘤医院妇科，福建 福州 350014；
3.福建医科大学肿瘤临床医学院/福建省肿瘤医院检验科，福建 福州 350014）
宫颈癌（cervical cancer）是全球女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，全世界每年有超过50 万女性被诊断为宫颈癌，死亡人数超过30 万，患有转移性或复发性疾病的宫颈癌患者总体预后较差[1]。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宫颈癌的主要危险因素。目前治疗宫颈癌的主要方法是手术、放疗、化疗，但发生局部或远处转移后，患者的5 年生存率将低于50%，总体预后仍然较差[2]。因此，对宫颈癌发生发展机制的分子生物学研究可能为晚期宫颈癌患者提供更好的治疗策略与改善患者预后提供潜在的新方向。Serpin 家族B 成员4（SERPINB4）是一种蛋白质编码基因。该基因编码的蛋白质是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员[3，4]。大多数SERPINS 是细胞外（血浆）分子，调节参与血液凝固、炎症、组织重塑和免疫反应的蛋白酶。这些SERPINS 通常属于SERPINB，作用于细胞质间中，因此参与机体生理功能[5]。肿瘤细胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达可以帮助肿瘤细胞逃离颗粒酶介导的细胞凋亡途径，并降低细胞免疫治疗的疗效[6]。在正常条件下，细胞毒性淋巴细胞释放含有丝氨酸蛋白酶（颗粒酶）诱导细胞凋亡以减少病毒感染和肿瘤细胞[7，8]。SERPINB 在多种恶性肿瘤中也有异常表达，促进肿瘤细胞增殖及侵袭[9]，但在宫颈癌中未见相关研究报道。因此，本研究拟探索SERPINB4 在宫颈癌中的诊断和预后价值。
1.1 资料来源 从肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表达量关联数据库（https://gtexportal.org/home，GTEx）下载306 例宫颈癌和13 例邻近宫颈组织SERPINB4 mRNA 数据，并下载了的相关临床数据文件，包括肿瘤浸润深度、远处转移、淋巴结分期、生存时间和生存状态。
1.2 SERPINB4 基因表达和临床特征的关系 采用R4.1.3 软件“Limma”包将宫颈癌组织与正常样本组织进行对比，分析SERPINB4 基因在两样本表达的差异。通过TIMER 数据库（http://timer.cistrome.org/）分析SERPINB4 在泛癌中转录组水平表达。运用“survival”包分析肿瘤浸润深度、远处转移、淋巴结分期、生存时间和生存状态与SERPINB4 的相关性并绘制生存曲线和ROC 曲线，再通过Kaplan-Meier plotter 数据库（https://kmplot.com/）予以验证。从HPA 数据库中（http://www.proteinatlas.org/）获取SERPINB4 免疫组化数据，SERPINB4 的蛋白阳性表达标本来源于一位70 岁患有宫颈鳞状细胞癌的患者，阴性表达的标本来源于一位37 岁女性的正常宫颈组织。
1.3 SERPINB4 共表达基因富集分析 运用R4.1.3软件对SERPINB4 基因进行共表达分析，得到显著相关的基因。为了确定SERPINB4 的生物学功能和潜在信号通路，使用R 软件中的“clusterProfiler”包和“org.Hs.eg.db”包，将筛选的相关基因进行GO 的生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及细胞成分（cellular component，CC）富集分析和KEGG 通路富集分析，按照P＜0.005进行筛选，探索其生物学功能和信号通路。
1.4 SERPINB4 表达与免疫浸润及治疗的关系 通过“ESTIMATE”包比较SERPINB4 高低表达组间免疫浸润评分、基质细胞浸润评分和综合评分差异，综合评分即是基质细胞评分和免疫细胞评分的综合。使用R 软件中的“CIBERSORT”包获取每个宫颈癌样本中免疫细胞的含量，对免疫细胞进行差异分析，得到免疫细胞在SERPINB4 基因高、低表达组之间的差异，将免疫检查点相关性与差异性的结果进行可视化。采用“pRRophetic”包计算SERPINB4 高低表达组间的药敏差异。
1.5 统计学方法 使用R 软件（版本4.1.3）进行统计分析，通过Kaplan-Meier 分析高低风险组之间的总生存期（OS）与对数等级，采用Mann-Whitney 比较不同组之间免疫细胞的ssGSEA 评分。双尾P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 SERPINB4 在泛癌中的表达 SERPINB4 在乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、直肠癌、皮肤黑色素癌、胃癌、甲状腺癌和子宫内膜癌均有表达，且与癌旁组织比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中在乳腺癌、结肠癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝癌、肺鳞状细胞癌和皮肤黑色素癌中高表达（P＜0.001），见图1。
图1 SERPINB4 在泛癌中的表达
2.2 SERPINB4 的表达与宫颈癌临床特征的关系 与正常组织比较，SERPINB4 在宫颈癌组织中的表达升高（P＜0.001），且与肿瘤转移（P=0.0092）呈负相关，SERPINB4 表达与肿瘤浸润深度及淋巴结分期无关；
SERPINB4 在宫颈癌鳞状细胞的细胞核内与细胞质中表达，呈现棕黄色染色颗粒。在宫颈癌组织中，阳性细胞分布均匀，染色深浅不一，SERPINB4表达高达75%以上；
在正常宫颈组织中抗体染色未检出SERPINB4，见图2。
图2 SERPINB4 的表达与宫颈癌临床特征的关系
2.3 SERPINB4 表达与宫颈癌预后的关系 SERPINB4 高表达组生存时间较差（P=0.035），通过Kaplan-Meier plotter 网站的GEO 数据进行验证，其总生存期（OS 曲线）结果与来源TCGA 数据相符（P＜0.05），见图3。
图3 SERPINB4 表达与宫颈癌预后的关系
2.4 SERPINB4 及共表达基因的功能富集 首先获取SERPINB4 的共表达基因；
GO 分析显示，SERPINB4及共表达基因的生物过程主要集中在角化细胞形成中，细胞成分集中在细胞质中，分子功能集中作为蛋白酶抑制剂调节宿主对肿瘤细胞的免疫反应。KEGG 通路富集分析显示，SERPINB4 及共表达基因参与了细胞的神经活性配体-受体的相互作用、钙信号通路和cAMP 信号通路等生物学功能正向调控，见图4。
图4 GO 和KEGG 富集分析
2.5 SERPINB4 表达与免疫浸润的关系 6 个TICs（激活CD4 记忆T 细胞、γδT 细胞、M1 巨噬细胞、静息树突状细胞、激活树突状细胞和中性粒细胞）与SERPINB4 表达呈正相关，3 个TICs（幼稚B 细胞、浆细胞和调节T 细胞）与SERPINB4 表达呈负相关；
SERPINB4 高表达组的免疫细胞评分和综合评分高于低表达组（P＜0.05）；
SERPINB4 表达与常见免疫检查点，如血管内皮细胞生长抑制剂（TNFSF15）、肿瘤坏死因子受体超家族成员18（TNFRSF18）、腺苷A2a 受体（ADORA2A）、程序性死亡配体1（CD274）和T 细胞免疫球蛋白粘蛋白受体3（HAVCR2）均有关，见图5。
图5 SERPINB4 表达与免疫浸润的相关性
2.6 SERPINB4 表达对宫颈癌患者靶向药物治疗敏感性的影响 SERPINB4 高表达组紫杉醇、塞卡替尼、拉帕替尼、厄洛替尼、环巴胺、伊斯平斯、HIF-PH抑制剂的IC50中位值高于低表达组（P＜0.01），见图6。
图6 SERPINB4 表达对宫颈癌患者靶向药物治疗敏感性的影响
宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，虽然现有的治疗策略改善了患者的临床结局，但晚期患者预后仍然较差[10]。因此，寻找与宫颈癌预后相关的生物学因素，针对致癌机制开辟一种新的治疗策略是很有必要的。
SERPINB4 在许多类型的恶性肿瘤均有表达并可能影响肿瘤的发生发展。SERPIN 家族最初被发现作为肿瘤特异性抗原，并用作各种鳞状细胞癌的肿瘤标志。SERPINB4 已被发现可影响多种癌症的发生和发展[11-14]。研究证明[15]，致癌Ras 通过ETS 家族转录因子PEA3 诱导宫颈癌组织中SERPINB3/4激活。宫颈癌组织中SERPINB4 的高表达的患者总体生存率较差，是患者预后不良的危险因素，在肿瘤T4和N2病理阶段表达更高。总之，SERPINB4 可能是具有潜在临床价值的宫颈癌预后因素，其高表达预示较差的生存及预后。
肿瘤微环境免疫细胞与基质细胞构成肿瘤组织的关键因素，研究表明其在预测肿瘤患者的生存状态和治疗效果方面具有重要意义[16，17]。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，可调节肿瘤进展。为了揭示SERPINB4 的ICI 治疗效果相关的潜在机制，本研究分析了SERPINB4 与肿瘤免疫浸润之间的关系，包括CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、B 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。SERPINB4 与免疫浸润显著相关，在SERPINB4 的高表达组中CD4 记忆T 细胞、M1 巨噬细胞与中性粒细胞等在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用[18]。这表明具有SERPINB4 高表达宫颈癌患者可归类为主动免疫亚型。同时，SERPINB4 高表达组免疫检查点基因的表达升高，包括FSF15、TNFRSF18、ADORA2A、CD274 和HAVCR2。这为SERPINB4 作为ICI 治疗预测生物标志物提供了重要证据。其中，在SERPINB4 高表达组中CD4 记忆T 细胞、M1 巨噬细胞与中性粒细胞等在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用。
本研究显示，SERPINB4 及其共表达基因的分子功能集在作为蛋白酶抑制剂调节宿主对机体的免疫机制，KEGG 通路富集发现SERPINB4 可能调控了cAMP 信号通路。cAMP 分子是细胞信号传导中的主要次级信使，它通过腺苷酸环化酶从三磷酸腺苷衍生而来，并调节许多生物过程[19]。在之前许多研究中报道cAMP 信号可能具有肿瘤促进作用。cAMP可以调节多种靶基因的转录，主要通过蛋白激酶A及其下游效应子如cAMP 反应元件结合蛋白[20]。因此，SERPINB4 可能通过影响cAMP 信号通路传导，从而逃避免疫监视促进肿瘤的发生发展。此外，本研究发现SERPINB4 高表达组较低表达组对化疗药物的敏感性低，说明SERPINB4 高表达患者可能对常规化疗药物耐药，如紫杉醇、厄洛替尼、拉帕替尼等。这表明患者可以通过靶向疗法从免疫治疗和化疗联合治疗中获益，可能有助于宫颈癌患者的精准、个体化治疗。
综上所述，SERPINB4 可以作为免疫微环境状态重塑的指标，也可以作为一个具有前景的临床结果预测因子，如宫颈癌的生存率、远处转移和对免疫治疗反应。然而，通过这种生物信息学分析仅揭示了SERPINB4 与宫颈癌的预后和免疫浸润相关性。后期将在体内和体外进行实验，从分子、细胞、组织及动物水平进一步探索SERPINB4 对宫颈癌的影响机制。
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